3D Cell Explorer-fluo kombinuje výhody neinvazivní buněčné tomo-holografie a multikanálové epi-fluorescence
Revoluční tomografický mikroskop 3D Cell Explorer vám umožní pozorovat živé buňky bez potřeby jakéhokoliv značení. Během vteřin můžete zaznamenat 3D obraz buněk ve vysokém rozlišení a sledovat buněčnou proliferaci, vzájemné interakce buněk, reakce buněk na přídavek různých látek, průběh virové či bakteriální infekce uvnitř buněk, akumulaci nanočástic a různé další buněčné procesy (apoptóza, nekróza, autofagie) atp.. 3D Cell Explorer může přinést novou dimenzy do výzkumu kmenových buněk, imunitních buněk nebo mitochondrií. Švýcarská společnost Nanolive vyvinula tento unikátní neinvazivní a velmi rychlý nástroj, který lze využít v různých oblastech výzkumných, ale i diagnostických, počínaje buněčnou biologií, neurologií a studiem interakcí buněk, přes onkologický a toxikologický výzkum, či vývoj nanomateriálů.3D Cell Explorer může sloužit také jako názorná pomůcka pro výuku přírodovědných předmětů.
Obr. Proliferace myších preadipocytů - fission & fusion mitochondrií.
Technologie Nanolive kombinuje holografii s rotačním skenováním a detekuje změny světla, které prochází buněčnými strukturami, tzn. 4D distribuci fyzikální veličiny lomu světla v buňce. Využívá toho, že každá buňka má svou vlastní komplexní strukturu. Vzorek se umístí mezi objektiv s vysokou clonou a rotační rameno se zdrojem světla, kterým je laserová dioda se zeleným paprskem o vlnové délce 520 nm. Laserový paprsek se rozděluje na dva paprsky, z nichž první prochází vzorkem a druhý je referenční. Vzorkem prochází laserový paprsek pod úhlem 45° a pomocí rotačního ramene se otáčí 360° okolo vzorku. Zaznamenává se série hologramů díky kombinaci referenčního paprsku a paprsku procházejícího vzorkem. Výsledný obraz se zobrazí na monitoru počítače již během 2 sekund. Mikroskop má velikost zobrazeného pole 80X80X30µm s vertikálním rozlišením 500 nm and laterálním 200 nm. Ač se tedy jedná o světelný mikroskop, tímto „trikem“ lze překonat omezení v rozlišení světelné mikroskopie dané vlnovou délkou světla a dostaneme se na úroveň skenovacího elektronového mikroskopu.
Obr. Schéma holografického a epifluorescenčního mikroskopu 3D Cell Explorer
Mikroskop je až překvapivě rozměrově malý, avšak velmi stabilní a elegantní. To je umožněno unikátním konstrukčním řešením jednolité základní konstrukce. Jeho ovládání je velmi snadné a možné ihned po krátkém zaškolení. Optika mikroskopu je samozaostřovací, což je zajímavé zvláště pro dlouhodobější sledování buněk. Je to možné i díky nízkoenergetickému laseru, který je vůči živým buňkám zcela šetrný. Mikroskop můžete doplnit malým inkubátorem a bez obav sledovat v přímém přenosu své buněčné vzorky v jejich přirozeném prostředí (5% CO2 & 37°C) po celé hodiny i dny a vaším omezením je pouze paměť připojeného počítače.
Obr. 3D Cell Explorer s malým "on-stage" inkubátorem od OKO-LAB pro kontrolu teploty, koncentrace CO2 a vlhkosti.
Základním grafickým výstupem je černobílý obraz složený ze 100 vrstev, mezi kterými lze přecházet. Obraz se vytváří z tzv. voxelů (3D pixely), což jsou specifické hodnoty indexu lomu a prostorových koordinát. Na rozdíl od fluorescence se jedná o absolutní hodnoty, které jsou vlastností daného biologického systému a jsou fyzikálním znakem organel. Díky tomu je možné snadno, a hlavně jednotně porovnávat vzorky z různých experimentů. Získaný obraz je možné převést do všech základních grafických formátů nebo použít tzv. digitální barvení.
Obr. Myší fibroblasty infikované Toxoplasmou gondii. Ukázka několika snímků vrstev jednoho obrázku.
3D obraz lze vytvořit za pomocí tzv. digitálního barvení v softwaru Steve od Nanolive, který lze stáhnout zdarma na libovolný počítač a zpracovávat snímky i dodatečně. Jak již bylo uvedeno, Nanolive vychází z toho, že hodnota indexu lomu je fyzikálním znakem buněčných organel. Software Steve dokáže snadno přiřadit zvolenou barvu k zadané oblasti indexů lomu. Výsledkem jsou krásné 3D rekonstrukce celých buněk. Atraktivní možností je vytvořit digitální řez buňkou a nahlédnout tak neinvazivně do intracelulárního prostoru. Kromě získání jednotlivých snímků je možné zachycovat videa a sledovat tak buňky v čase. I pro účely videosekvencí lze s výhodou použít digitálního barvení a sledovat v přímém přenosu pohyby digitálně obarvených buněk ve 3 D.
Obr. Apoptotizující lidská nádorová buňka (linie T685A). Barevná vizualizace ve 3D pomocí softwaru Steve, který si můžete volně stáhnout do svého počítače.
Poslední inovativní novinkou od Nanolive je rozšíření mikroskopu 3 D Cell Explorer o fluorescenční modul. Můžete tak využít zároveň výhod jak neinvazivní buněčné tomografie, tak i multikanálové epifluorescence. 3D Cell Explorer-fluo disponuje třemi fluorescenčními kanály.
Obr. Kombinace holografie a epi-fluorescence pro detekci intracelulárních struktur (zleva: lysosomy, mitochondrie, lipidové kapénky, aktinová vlákna).
3D Cell Explorer se dostal v roce 2015 mezi The Scientist’s Top 10 Innovations. Tato technologie je přelomová možností zachytit v přirozeném prostředí a zároveň ve vysokém rozlišení buňky, aniž by bylo potřeba je barvit. Oproti nestabilnímu fluorescenčnímu značení, které je relativní veličinou, je index lomu jednotlivých organel veličinou absolutní, což umožňuje dlouhodobé studie, porovnání různých vzorků stejného biologického původu a zcela neinvazivní dlouhodobé pozorování buněk.
Další krásné ukázky aplikací naleznete na stránkách výrobce Nanolive zde.
Pokud vás zajímají další informace, chtěli byste si vyzkoušet mikroskop na vašich buňkách nebo máte zájem o konzultaci s naším produktovým specialistou, pište na adresu: dgg@hpst.cz nebo volejte Michaelu Pluskalovou: 736 606 878.
