REBUS ESPER je plně integrovaný, automatizovaný systém pro analýzu transkripce na úrovni individuálních molekul RNA, či proteinů v rámci jednotlivých buněk s extra informací o pozici buňky v preparátu. Analytické eseje ESPER High Fidelity (bez barkódování) a ESPER High Plex (s barkódováním) jsou založené na zlatém standardu zobrazujících metod fluorescenční in-situ hybridizaci na úrovni jedné molekuly (smFISH).
Vysoká citlivost a specificita těchto esejí umožňuje analýzu buněčné exprese mnoha desítek genů a identifikaci typů buněk na základě i několika málo genových markerů. Identifikace transkriptů, či proteinů co-lokalizovaných s RNA probíhá na základě sekvenčně specifických prób. Vizualizace transkriptů na sub-celulární úrovni probíhá systémem hybridizace specifických prób a tzv. „čtecích“ prób nesoucích jednu z vybraných ATTO fluorescenčních sond.
Systém je vybaven čipem s integrovaným fluidním systémem, který umožňuje automatickou cyklickou výměnu čtecích prób. Tím je možné v jedné analýze definovat transkripci mnoha desítek genů, či proteinů. Speciální detekční kanál je vyhrazen pro analýzu fluorescence DAPI, kterou se identifikuje jádro buňky, díky čemuž je možné signál jednotlivých RNA (proteinů) dedikovat jednotlivým buňkám.
Součástí systému je sada výkonných softwarů Esper Spatial Studio pro ovládání přístroje (Esper Control), zpracování dat (Esper Process) a vizualizaci (Esper Explore). Esper Process zpracovává obrázky metodou „Syntetic aperture optics (SAO)“ jež umožňuje vytvořit pomocí kombinace obrázků s nižším rozlišením obrázky s vysokým rozlišením. Podobně jako se při sekvenování DNA vytvářejí konsenzuální sekvence. Dále zajišťuje definici světelných bodů, plochy buňky a jejich vzájemné propojení. Tento proces probíhá real-time a na finální data tedy není třeba čekat další (delší) dobu po dokončení přístrojové analýzy.
Výstupem statistického zpracování dat je tzv. „CellxFeature matrix“, tedy tabulka definující pozici buňky a zaznamenané události v rámci buňky. Výsledky lze vizualizovat pomocí Esper Explore nebo dále zpracovávat nezávislými programy.
Pracovní postup:
A – esej s libovolně vybranými geny
- Navržení prób pomocí softwaru výrobce a objednání originálních reagencií RebusBiosystems (čtecí próby, pufry)
- Syntéza specifických prób obecným výrobcem značených olig
- Příprava preparátu
- Fixace preparátu na čip
- Nastavení přístroje a instalace pufrů
- Automatická analýza
B – pre-designované eseje
- Objednání pre-designovaných esejí pro mapování buněčných typů napříč různými tkáněmi.
- Objednání originálních reagencií RebusBiosystems (čtecí próby, pufry)
- Příprava preparátu
- Fixace preparátu na čip
- Nastavení přístroje a instalace pufrů
- Automatická analýza
Metodologicky standardní parametry
- Použití prověřené smFISH metodiky
- Rozlišení analogické 100X imerznímu zobrazení (260 nm)
- 4 detekční kanály
Unikátní parametry
- Aplikace smFISH metodiky na úrovni RNA
- Použití metody Synthetic aperture optics (SAO) pro detailnější zobrazení
- Plně automatizovaná výměna čtecích prób v až 10ti hybridizačních cyklech
- Analýza plochy preparátu až 3 cm2 – vcelku nebo jako výběr menších oblastí
- Tkáňově specifický pre-treatment vzorku pro optimální analýzu
- Tkáňově specifické eseje pro „cell-type-mapping“ (pro modelové organismy člověka a myš)
- Detekce/analýza stovek tisíc buněk a desítek milionů transkriptů
Aplikace
- Mapování typů buněk
- Validace scRNA dat
- Detekce vzácných buněk
- Identifikace genů s nízkou hladinou exprese
Eseje
- ESPER High Fidelity assay (analýza 30ti RNA, Fresh frozen preparáty, custom, nebo predesignované pro H/M)
- ESPER High Fidelity assay (1H2022) (analýza 50ti RNA a 10ti proteinů, Fresh frozen/FFPE preparáty, custom, nebo predesignované pro H/M)
- ESPER High Plex assay (1H2022) (analýza 400+ RNA či proteinů, Fresh frozen/FFPE preparáty, custom, nebo predesignované pro H/M, metoda barcoded FISH)
- ESPER High Plex assay (2H2022) (analýza 1300+ RNA či proteinů, Fresh frozen/FFPE preparáty, custom, nebo predesignované pro H/M, metoda barcoded FISH)
Technické údaje
- Typ vzorku: tkáň, nebo fixované buňky; Fresh frozen nebo FFPE; průměr řezu max 12 µm
- Rozlišení: 260 nm
- Objektiv: Nikon CFI S Plan Fluor ELWD 20xC, 0.45 NA
- Kamera: Andor sCMOS Zyla 4.2 Plus
- Lasery: 532 nm (2W), 595 nm (2W), 647 nm (2W)
- Další zdroje: 365 nm LED
- Čas analýzy: 2 dny při maximálním počtu cyklů (3 cykly/9 genů = 20h; 10 cyklů/30 genů 2 dny
Součásti systému
- Přístroj Rebus Esper
- Mikrofludní čip
- Sada softwarů (Esper Control, Process, Explore)
- Dva nezávislé počítače – jeden pro ovládání přístroje a druhý pro zpracování dat
- Monitor
Publikace:
An atlas of cortical arealization identifies dynamic molecular signatures
Bhaduri, A., Sandoval-Espinosa, C., Otero-Garcia, M. et al. An atlas of cortical arealization identifies dynamic molecular signatures. Nature 598, 200–204 (2021)
