Jak Seahorse analyzátory měří extracelulární tok (extracellular flux)
Agilent Seahorse XF analyzátory měří spotřebu kyslíku (OCR-oxygen consumption rate) a okyselování extracelulárního prostředí (ECAR-extracellular acidification rate) v intervalech 5-8 minut. OCR je indikátor mitochondriální respirace. ECAR je zejména produktem glykolýzy.
Měření OCR a ECAR v reálném čase se provádí v dočasně vytvořené mikrokomůrce, která vznikne tím, že se dočasně oddělí malý prostor s médiem (2, resp. 7 μl) nad monovrstvou buněk, které jsou kultivovány nebo nasazeny na mikrodestičce.)
Buněčná spotřeba kyslíku – respirace, a vylučování protonů – glykolýza způsobují rychlé, snadno měřitelné změny v koncentraci rozpuštěného kyslíku a volných protonů v této dočasné mikrokomůrce (transient microchamber). Tyto změny jso měřeny každých pár sekund pomocí pevných prób umístěných několik mikrometrů nad monovrstvou buněk. Z takto získaných dat poté přístroj postupně vypočítá OCR a ECAR.
Jakmile měření proběhne, próby se zvednou, což umožní promíchání malého objemu v dočasné mikrokomůrce s velkým objemem mimo ni. Tím se mohou vrátit hodnoty OCR a ECAR do výchozího bodu (baseline). Integrovaný systém přísunu látek umožňuje postupné přidávání až 4 různých látek v definovatelných intervalech do každé jamky.
Jak se provádí měření XF
Před samotoným měřením XF se musí buňky nasadit do jamek v mikrodestičce nebo se v ní mohou buňky přímo nakultivovat. Pro vlastní měření se používá médium s nízkou pufrační kapacitou (dodává Seahorse). Do kazet se mohou přidat až 4 různé látky, které jsou automaticky přidávány během měření. Nejprve se umístí kazeta do analyzátoru, aby se mohly kalibrovat optické senzory. Poté se vloží destička s buňkami.
Běžně se výchozí hodnoty OCR a ECAR změří 3x až 4x a teprve poté se zažnou měřit hodnoty za přítomnosti inhibitorů, stimulantů, substrátů nebo jiných látek, které jsou přidávány pomocí integrovaného injekčního systému. OCR se měří v jednotkách pmol/min, ECAR v mpH/min. Látky, které byly připraveny pro injekci, jsou během měření postupně pneumaticky injektovány do média v každé jamce. Po mírném promíchání se OCR a ECAR změří několikrát za sebou.
Díky tomu, že Seahorse XF metody nejsou destruktivní, je možné měřit rychlost metabolismu na stejné populaci buněk opakovaně s přidáním až 4 různých látek do každé jamky. Celé měření trvá 60-90 minut. Po skončení tohoto měření je možné provádět další analýzy se stejnými buňkami na stejné destičce, jako například životaschpnost buněk. Pro udržení běžné buněčné fyziologie je udržována teplota buněčného prostředí na 37°C pomocí systému kontroly reploty.
Odkazy na videa:
Výukové centrum na stránkách Agilent Technologies vás podrobně provede všemi procedurami a upozorní vás na kritická místa v průběhu experimentu Seahorse XF jako je nasazení adherentních buněk, příprava senzorové kazety, titrace FCCP atp. V základním menu si zvolte typ analyzátoru, který chcete použít a postupně si projděte krok za krokem celou analýzu. Odkaz na výukové centrum je zde.
Seahorse XF Kity a reaktanty
Kompletní, snadno použitelné kity a reaktanty pomáhají usnadnit měření buněčné bioenergetiky poskytováním zkalibrovaných otestovaných reaktantů pro metabolickou fenotypizaci, mitochontriální respiraci, glykolýzu a oxidaci mastných kyselin v buňkách.
Vyzkoušejte sami a uvidíte
Od roku 2006 byla technologie Seahorse XF použita téměř ve 4 000 publikacích. Tato technologie umožňuje vědcům v různých oblastech lépe porozumět jejich buněčným modelům a činit zásadní objevy o roli metabolismu v různých onemocněních.
Nejnovější publikace,které se týkají technologie XF a přístrojů Agilent Seahorse XF můžete nalézt proklikem na All new publications.
Více publikací naleznete na těchto stránkách: Cell Reference Database, kde můžete vyhledávat publikace podle autora, oblasti výzkumu nebo typu buněk.
Internetové semináře (webinars) o různých aplikacích technologie Seahorse XF naleznete na tomto odkazu.
- Přístroje a kity SeahorseXF objednávejte u HPST, s.r.o., autorizovaného distributora Agilent Technologies.
- Seahorse XF snadno naleznete na stránkách Agilent zde:.
- Pokud vás zajímají informace o novinkách nebo chystaných workshopech či prezentacích Seahorse, pište na adresu: dgg [at] hpst.cz nebo volejte na č. 244 001 245 nebo 736 606 878.
Další zajímavé informace na stránkách Agilent Technologies:
Cell Reference Database -vyhledejte si vědecké publikace, ve kterých byla použita metabolická analýza Seahorse XF podle typu buněk, buněčné linie, výzkumné oblasti nebo autora publikace.
Publications Database - publikace obsahující data získaná Seahorse XF analýzou, propojená na PubMed.gov.
XF Instrument Selection Guide - obecné specifikace a vlastnosti různých modelů analyzátorů Seahorse.
Basic Procedures & Assay Protocols - protokoly, které provedou analýzou Seahorse krok po kroku.
Cell Analysis Travel Awards - podpora cestovných nákladů pro vědce, kteří prezentují citovaná data s využitím Agilent Cell Analysis technologie.
XF Analyzer Grant Expeditor Package - souhrn základních vlastností analyzátorů Agilent Seahorse XF pro přípravu grantových aplikací.
XF Core Facilities - laboratorní centra, která umožňují přístup k technologii Agilent Seahorse XF, zahrnující poradenství experimentálního designu, analýzi dat, základního tréninku, bioinformatiky na základě úhrady nákladů. Pokud máte zájem o kontakty na pracoviště používající Agilent Seahorse XF v České republice, tak pište na dgg [at] hsp.cz.
Lab Instrument Service Agreements – plán pro pravidelný sevis přístroje pro zajištění plynoulého a hladkého provozu.
Těšíme se na spolupráci s vámi!
