Doporučené postupy pro používání HPLC systému Agilent

Doporučené postupy pro používání HPLC systému Agilent

V tomto článku Vám přiblížíme osvědčené postupy a doporučení, jak pracovat s HPLC systémy Agilent Technologies. Začneme základními pravidly.

Záznam přednášky z Novinky a trendy (nejen) Agilent Technologies 2023: Předcházejte problémům v HPLC s využitím příslušenství Agilent

Práce a nakládání s rozpouštědly

• Používejte pouze čisté borosilikátové skleněné lahve.
  • Před novým doplněním vypláchněte láhev příslušným rozpouštědlem.
  • Láhve mohou být kontaminovány čisticími prostředky z myčky nádobí.
• Používejte vstupní filtry pro rozpouštědla pro ochranu systému před cizími částicemi.
• Rozpouštědla s obsahem vody vyměňujte jednou denně.
  • Řasy nebo růst bakterií můžou zablokovat odplynovač nebo filtry.
  • Vysrážené nerozpustné soli můžou zablokovat filtry nebo kapiláry.
• Připravte si objem rozpouštědla, který spotřebujete do 1–2 dnů.
• Používejte pouze rozpouštědla a vodu třídy HPLC.
  • Všechna připravená organická rozpouštědla, směsi a vodné pufry musí být filtrovány přes filtr 0,2 μm.
  • Rezidua nebo kontaminace mohou zablokovat filtry nebo kapiláry.
• Na láhve správně vyznačte obsah a datum plnění a spotřeby.
• Snižte riziko růstu řas: pro vodní rozpouštědla používejte hnědé láhve; láhve nevystavujte slunečnímu záření, nebo je zabalte do hliníkové fólie.

Zvláštní doporučení pro acetonitril (ACN)

• ACN a další organická rozpouštědla lze filtrovat 0,2 μm pomocí filtrační membrány z PTFE (například 5191–4339).

• Použijte hnědé lahve a naplňte je objemem ACN, který se má spotřebovat do 1-2 dnů, aby se zabránilo fotochemickým reakcím a oxidaci.

  ---

  POZNÁMKA: Filtrování pomocí nylonových filtrů se nedoporučuje pro vysoce citlivé LCMS analýzy.

  ---

  Jak připravovat vzorky

  ---

  VAROVÁNÍ: Možné srážení vzorku

• Ujistěte se, že vzorek je zcela rozpustný jak v ředicím roztoku vzorku, tak v mobilní fázi.
• Upravte ředicí roztok vzorku tak, aby co nejvíce odpovídal počátečnímu složení mobilní fáze, aby se zabránilo vysrážení, tlakovým rázům a píkům rozpouštědla v chromatogramu.

---

• Upřednostňovanou metodou je filtrování nerozpustné frakce ve vzorku přes 0,2 μm filtry a tak zabránění ucpání systému. Není-li to možné, vorky důkladně odstřeďte a dejte pozor, aby nedošlo ke kontaminaci supernatantu sraženinou při jeho dekantování nebo nasávání.
• Ujistěte se, že rozpouštědlo, kterým vzorek ředíme neobsahuje žádné částice.
• Nefiltrované vzorky způsobují ucpávání a kontaminaci průtokových cest, což může mít za následek trvalé zvyšování zpětného tlaku systému a tlakové anomálie, jako jsou zvlnění nebo náhlé poklesy. Změny tlaku mohou ovlivnit reprodukovatelnost chromatografických výsledků.
• Například nefiltrované vzorky proteinů mohou způsobit tvorbu proteinového filmu, který může časem ucpat průtokovou cestu a významně zkrátit životnost chromatografických kolon.

Doporučuje se používat inline filtry, aby se zabránilo vniknutí částic do průtokové cesty a poškození ventilů, kolon a detektoru.

Jak vyčistit HPLC systém

• Pokud existuje podezření na bakteriální kontaminaci systému, lze použít následující postup čištění systému.
  • Aplikujte následující roztoky postupně při mírném průtoku (0,5 – 1 ml/min) a to každý po dobu alespoň 30 minut:
    • a. voda
    • b. 0,1 M NaOH
    • c. voda
    • d- 0,13 M HCl
    • e. voda
• Při práci s biokompatibilními pufrovacími systémy (např. fosfát, acetát) je třeba věnovat zvláštní pozornost prevenci tvorby biofilmu.
  • Postup čištění systému (popsaný dříve) musí být proveden, jakmile je pozorován pokles chromatografické reprodukovatelnosti na všech kanálech rozpouštědel, které se používají pro biokompatibilní pufry.
• Při provádění jakéhokoli čisticího postupu HPLC systému se ujistěte, že kolona a detektor jsou vyloučeny z průtokové cesty.

Chromatografické kolony používané pro separace biomolekul, jako je vylučovací chromatografie nebo iontoměničová chromatografie, by měly být skladovány v přítomnosti 0,02 % azidu sodného.

Denní/týdenní úlohy

Denní úlohy

• Rozpouštědla a láhve s rozpouštědly u mobilní fáze vyměňujte podle množství vody/pufru.
• Rozpouštědla a láhve s rozpouštědly u organické mobilní fáze vyměňujte alespoň každý druhý den.
• Zkontrolujte přítomnost rozpouštědla pro oplach těsnění.
• Každý kanál před použitím proplachujte čerstvým rozpouštědlem při 2,5 – 3 mL/min po dobu 5 min.
• Systém ekvilibrujte složením a průtokem mobilní fáze pro následující metody.

Týdenní úlohy

• Vyměňte rozpouštědlo pro oplach těsnění (10 % izopropanolu ve vodě) a láhev.
• Pokud byly prováděny aplikace s použitím solí, propláchněte všechny kanály vodou (podrobnosti viz „Postup proplachování“ v dalších dílech) a případné usazeniny soli odstraňte ručně.
• Zkontrolujte nečistoty nebo blokace u filtrů rozpouštědel. Pokud se po odpojení ze vstupu odplynovače neobjeví žádný průtok z dráhy rozpouštědla, proveďte výměnu.

---

VAROVÁNÍ: Kontaminace rozpouštědla pro oplach těsnění

---

  Poškození pístů a těsnění

• Rozpouštědla pro oplach těsnění nerecyklujte.
• Rozpouštědlo pro oplach těsnění vyměňujte jednou týdně.
• Typická spotřeba rozpouštědla: 0,5 L týdně.
• Důrazně se doporučuje použití sady láhví pro oplach těsnění (5067-6131)

• Zapnutí/vypnutí systému

Zapnutí systému

• Zajistěte, aby všechny moduly byly v prostředí se stabilní teplotou a chráněny před přímým slunečním světlem.
• Zapněte všechny moduly a připravte je podle následujících pokynů:

Příprava čerpadla

• Použijte čerstvou nebo jinou mobilní fázi (podle potřeby).
• Každý kanál proplachujte při 2,5 – 3 mL/min po dobu 5 min. Podle typu čerpadla otevřete ruční proplachovací ventil nebo použijte příkaz k proplachu.

Příprava autoampleru

• Nepoužívejte funkci oplachování jehly a zpětného proplachování sedla organickými rozpouštědly při analýzách využívajících pufr, protože by mohlo dojít k vysrážení soli v sedle jehly.
• Při použití oplachu jehly a/nebo zpětného proplachu sedla:
  • Vždy používejte čerstvá rozpouštědla.
  • Dobrou možnost představuje metanol, ACN, izopropanol, voda a jejich směsi.
  • Nepoužívejte mísitelné roztoky ani precipitační mycí roztoky.
• Při použití chlazení/termostatování vzorků
  • Zapněte chladič/termostat a počkejte, dokud nebude dosaženo cílové teploty a dokud se teplota nestabilizuje.
  • To lze provést v době, kdy se zahřívá se lampa detektoru.
• Ujistěte se, že vialky obsahují dostatečné množství vzorku pro všechny nástřiky.

Příprava detektoru

• Zahřívejte lampu alespoň 1 h tak, aby byla zaručena základní stabilita.
• Pouze pro RI detektory (refraktometrické detektory): zapněte ohřev a propláchněte referenční stranu a stranu vzorku čerstvým rozpouštědlem, které se používá pro aktuální analýzu.

Ekvilibrace systému

• V době kdy se lampa detektoru zahřívá, stabilizujte systém (včetně kolony a detektoru) s nastavením parametrů analýz po dobu alespoň 15 min, dokud nebude stabilní tlak a signál základní linie detektoru.

Vypnutí systému

• Kolonu propláchněte příslušnými rozpouštědly a uložte podle pokynů v návodu k použití kolony (ujistěte se, že proplachovací rozpouštědlo je kompatibilní s rozpouštědlem obsaženým v systému, aby se zabránilo precipitaci).
• Instalujte spojku nebo restrikční kapiláru a důkladně propláchněte systém vodou, zejména po použití pufrů. Podrobnosti naleznete v dalších dílech.
• Systém propláchněte a konzervujte v 50 % methanolu nebo 50 % isopropanolu ve vodě bez přísad.
• Odeberte všechny vzorky z autosampleru a uložte je v souladu se správnou laboratorní praxí.
• Všechny moduly odpojte od zdroje napájení.

Doporučení pro odplynovače/degaséry

---

VAROVÁNÍ: Kapalina uvnitř degaséru

V případě kondenzace rozpouštědel s nízkým bodem varu nebo v případě netěsnosti se může uvnitř komor odplyňovače hromadit kapalina, což by narušilo výkon.

Když k tomu dojde:

• Propláchněte všechny kanály rozpouštědla izopropanolem.
• Nepoužívané kanály ponechte naplněny izopropanolem.

---

 

• Zkontrolujte kompatibilitu rozpouštědel s odplynovačem a aplikací

  

  • Pro RI aplikace používejte samostatné standardní degaséry (G1322A nebo G7122A), s průtoky vyššími než 5 mL/min, s rozpouštědly s nízkým bodem varu (<60 °C) a s hexanem, tetrahydrofuranem a jakýmikoliv halogenovanými rozpouštědly.
  • Pro všechny ostatní aplikace použijte integrovaný nebo samostatný vysoce výkonný degasér (G4225A).
• Pokud nelze dosáhnout nebo udržet dostatečný podtlak pro optimální výkon odplynění (jak je indikováno žlutou nebo červenou stavovou kontrolkou LED na samostatných odplyňovačích nebo specifickými chybovými zprávami na integrovaných odplyňovačích), modul vypněte a zapněte.
• Pokud po vypnutí a opětovném zapnutí napájení nelze dosáhnout nebo udržet podtlak na integrovaných odplyňovacích systémech, použijte Evacuation Mode, který je k dispozici na obrazovce ovládání přístroje systému v Agilent Lab Advisor.

---

POZNÁMKA: Při zahájení Evacuation Mode postupujte podle příslušných pokynů.

---

Doporučení pro čerpadla

• Pravidelně kontrolujte výkon čerpadla sledováním signálu tlaku.
• Preventivní údržbu provádějte v doporučených intervalech.
• Připravte čerpadlo podle doporučení v kapitole popisující proces zapínání čím zajistite jeho optimální výkon a maximální životnost.
• Při výměně rozpouštědel zajistěte, aby nové rozpouštědlo bylo mísitelné s předchozím rozpouštědlem (v případě potřeby použijte jako mezikrok další mísitelné rozpouštědlo).
• Použijte funkci oplach těsnění, podle doporučení, čím zajistěte optimální výkon a maximální životnost, viz „Oplach těsnění“ níže.

Doporučení pro čerpadla s MCGV

Vyberte kanál vícekanálového gradientového ventilu (MCGV)

• Pro roztoky pufrů použijte dolní kanály (A a D).
• Pro odstranení případných usazenin solí všechny kanály MCGV pravidelně proplachujte 200 mL vody.
• Kontrolujte kompatibilitu pufrů a organických rozpouštědel, abyste zabránili vysrážení v směšovací komoře MCGV.

  ---

  POZNÁMKA: Při míchání nekompatibilních rozpouštědel může docházet ke srážení soli v místě míchání a k následné blokaci průtokové cesty a poškození dílů.

  ---

  Oplach těsnění (používání je povinné, pokud je modul nainstalován)

Oplach těsnění (G4204A, G4220A, všechna čerpadla 1260)

---

VAROVÁNÍ: Kontaminace rozpouštědla pro oplach těsnění. Poškození pístů a těsnění.

• Rozpouštědla pro oplach těsnění nerecyklujte.
• Rozpouštědlo pro oplach těsnění vyměňujte jednou týdně.
• Typická spotřeba rozpouštědla: 0,5 L týdně.
• Důrazně se doporučuje použití sady láhví pro oplach těsnění (5067-6131).

---

Použití funkce oplach těsnění je povinné při používání pufrů a dalších netěkavých rozpouštědel nebo přísad, které se mohou usazovat na pístech a těsněních. Funkce oplachování těsnění pravidelně a automaticky tyto části čistí.

Výhody používání Oplachu těsnění:

• Odstranování částic, krystalů solí a dalších netěkavých zbytků z pístů a těsnění (mohou poškodit píst a těsnení pístu)
• Mazání třecích ploch těsnění/píst
• Chlazení pístů

Nastavení oplachu těsnění ve vašem CDS software

Nastavení naleznete na obrazovce ovládání; doporučuje se používat nastavení zobrazená na obrázku níže.

Uvědomte si, že:

• Nastavení oplachu těsnění NESPADÁ pod parametry metody (protože nastavení ovládání přístroje jsou aplikována na všechny metody používané v konkrétním přístroji).
• Oplach těsnění musí být znovu manuálně zapnut po následujících úkonech:
  • pokud byla smazána CHYBOVÁ hláška
  • Zapnutí.

Funkce a provoz oplachu těsnění:

• PRAVIDELNÝ provoz, například 0,5 min každých 7 min.
  • Nastavení lze změnit na obrazovce ovládání, viz níže.
  • Nastavení jsou přístupná prostřednictvím kontextového menu, viz níže.
  • Typická hodnota průtoku rozpouštědla je 0,7 mL/min. To odpovídá přibližné spotřebě 3 mL/h nebo 0,5 l/týden při konstantním provozu.
• Použijte
  • 10 % izopropanolu ve vodě.
  • 100 % izopropanol pro aplikace s normálními fázemi.
• Umístěte láhev s rozpouštědlem pro oplach nad chromatografem a láhev s odpadem pod chromatografem.
• Nikdy láhev s rozpouštědlem pro oplach nedoplňujte. Vždy používejte řádně vyčištěné a nové láhve.
• U čerpadel, která nejsou vybavena senzorem oplachu těsnění, proveďte test peristaltického čerpadla.
  • Dotkněte se peristaltického čerpadla prstem a zkontrolujte, zda toto čerpadlo správně funguje, nebo zkontrolujte průtok rozpouštědla oplachu těsnění pohledem na rozpouštědlo kapající z hadičky.

Oplachování těsnění (G7104A, G7104C, G7120A a G7132A)

 

---

VAROVÁNÍ: Kontaminace rozpouštědla pro oplach těsnění. Poškození pístů a těsnění.

• Rozpouštědla pro oplach těsnění nerecyklujte.
• Rozpouštědlo pro oplach těsnění vyměňujte jednou týdně.
• Typická spotřeba rozpouštědla: 0,5 L týdně.
• Důrazně se doporučuje použití sady láhví pro oplach těsnění (5067-6131).

  ---

  Čerpadlo pro oplachování těsnění pracuje nejen tehdy, když běří analytická metoda, ale také v pohotovostním stavu nebo ve stavu není připraveno.

Funkce oplach těsnění pravidelně automaticky čistí písty a těsnění od usazenin.

Senzor oplachu těsnění bude provádět neustálou kontrolu výkonnosti systému oplachu těsnění. V případě výskytu anomálie bude senzor informovat uživatele.

Funkce a provoz oplachu těsnění:

• Interval oplachu těsnění je nastaven na 30 s každých 7 min.
• Průtok je nastaven na 500 μL/min.
• Integrita systému k oplachování těsnění je kontrolována v pravidelných intervalech.
• Běžná spotřeba rozpouštědla pro oplach je asi 0,5 L za týden.
• Použijte
  • 10 % izopropanolu ve vodě.
  • 100 % izopropanol pro aplikace s normálními fázemi.
• Umístěte láhev s rozpouštědlem pro oplach nad chromatografem a láhev s odpadem pod chromatografem.
• Nikdy láhev s rozpouštědlem pro oplach nedoplňujte. Vždy používejte řádně vyčištěné a nové láhve.
• NERECYKLUJTE lahve určené pro rozpouštědla k oplachování těsnění.
• Pokud senzor oplachu detekuje nějaké nesrovnalosti, bude EMF symbol svítit žlutě.
  • Vyměňte rozpouštědlo pro oplach těsnění a spusťte funkci oplachu těsnění prostřednictvím kontextového menu
  • Zkontrolujte hadičky oplachu těsnění a filtr, zaměřte se na prakliny, netěsnosti nebo ucpání.
  • Zkontrolujte případné úcpání u hadičky pro odpad. Zkontrolujte, zda odpadní rozpouštědlo volně odtéká:
    • Pokud se odpadní rozpouštědlo usazuje v hadičce, nemůže snímač správně fungovat

Doporučení pro autosamplery

• Před vypnutím nebo dlouhým pohotovostním režimem vždy:
  • Odstraňte pufr pomocí vody se stupněm HPLC (viz. „Postup propláchnutí“ v dalších dílech).
  • Proveďte alespoň 15 minut proplachování sampleru vodou (vnější oplachování jehel i zpětné proplachování sedla pro volbu vícenásobného oplachování).
  • Proveďte vizuální kontrolu, v případě potřeby ručně odstraňte zbytky soli.
  • Odstraňte znečišťující látky pomocí silného rozpouštědla, například pomocí čistého ACN.
  • Funkce automatického čištění slouží k propláchnutí sampleru a současně k přepínání nástřikového ventilu tam a zpět.

• Pro funkci oplachu jehly nebo zpětného proplachu sedýlka vždy používejte čisté oplachovací rozpouštědlo.
• Umístěte lahev s rozpouštědlem pro oplach jehly a zpětný proplach sedýlka k ostatním HPLC rozpouštědlům.

Používejte správné rozpouštědlo, podle vlastností vzorku a mobilní fáze.

---

POZNÁMKA: Složení rozpouštědla pro oplach jehly musí odpovídat co rozpouštědlu s největší silou (rozpouštělo s maximální rozpustností). Volba těchto promývacích rozpouštědel je součástí procesu vývoje metody. Směs 50 – 100 % organického rozpouštědla v destilované vodě je pro mnohé aplikace ideálním řešením.

---

• Zkontrolujte odpadní hadičku výstupu z oplachového portu do odpadní nádoby.
• Každou vialku naplňte dostatečným množstvím vzorku pro všechny nástřiky.
  • Používejte pouze vialky doporučené společností Agilent.
  • Vialky nepřeplňujte; doplňujte je pouze po hladinu 90 %.
  • V případě dávkování velkých objemů nebo opakovaných nástřiků ze stejné vialky použijte septa se štěrbinou.

Proveďte filtraci, usazení nebo odstředění vzorku pro jeho oddělení od nerozpustných pevných částic.

---

POZNÁMKA: V rozpouštědle nesmějí být žádné cizí částice, musí být primárně vždy filtrované.

---

• Zajistěte, aby rozpouštědlo pro vzorky co možná nejvíce odpovídalo složení reálné mobilní fáze.

Vícenásobný oplach

Modul pro vícenásobný oplach je určen pro minimalizaci přenosu vzorků a lze ho nainstalovat do libovolného multisampleru Agilent.

Tato funkce minimalizuje přenos a kontaminaci u důležitých vzorků tím, že umožňuje:

• Vnější oplach jehly až třemi různými rozpouštědly
• Zpětné propláchnutí sedýlka až se třemi různými rozpouštědly

Použití funkce Vícenásobné oplachování se nedoporučuje u mobilních fází obsahujících soli, protože sůl krystalizuje na jehle a sedýlku jehly. Vzhledem k drahám průtoku modulu pro vícenásobný oplach platí, že když se dávkovací zařízení před násřikem přesune do výchozí polohy, mobilní fáze bude vytékat z hrotu jehly a může kápnout do sedýlka. Jedná se o očekávané chování, nezávislé na nastavení dráhy čištění násřiku a neznamená to žádnou netěsnost.

Je-li modul pro vícenásobný oplach instalován v systému s mobilními fázemi obsahujícími sůli, doporučuje se pro zabránění hromadění soli na jehle a sedle denně proplachovat multisampler vodou po dobu 15 minut a vizuálně zkontrolovat jehlu a sedýlko. V případě potřeby použijte k manuálnímu čištění jehly, sedýlka a dalších součástí, které stále obsahují zbytky soli, látku nepouštějící vlákna, namočenou v destilované vodě.

Kdy je vhodné používat modul pro vícenásobný oplach?

• Je-li systém určen pouze pro aplikace s reverzními fázemi a v mobilní fázi nejsou přítomny žádné látky náchylné na vysrážení.
• Je-li systém určen pro aplikace s mobilními fázemi obsahujícími soli, použití varianty vícenásobného oplachu se nedoporučuje. Pokud je však tento volitelný modul nainstalován, může dojít ke krystalizaci v oblasti jehly a sedýlka. Je proto vhodné dodržovat následující postupy:
  • Denně provádějte proplachování vodou po dobu 15 minut, aby se odstranily zbytky soli.
  • Proveďte vnější oplach jehly a zpětné propláchnutí sedýlka.
  • Vizuálně zkontrolujte jehlu / sedýko / proplachovací port, zda neobsahují zbytky soli.
  • V případě potřeby ručně vyčistěte jehlu / sedýlko / proplachovací port.

---

POZNÁMKA: Pokud tyto postupy nejsou dodržovány, dojde k ucpání jehly a sedýlka.

---

• Je-li systém určen pro střídavé aplikace s mobilními fázemi obsahujícími sůl a aplikacemi s reverzními fázemi, není možnost vícenásobné oplachu podporována. Existuje vysoké riziko, že budou nepřetržitě uvolňovány zbytky solí a buď naruší chromatografii reverzní fáze, nebo dokonce způsobí ucpání systému.

V průtokových cestách modulu pro vícenásobný oplach také postupně stárne značné množství rozpouštědla, což by mohlo vést ke zvýšenému pozadí u vysoce citlivých UV a MS měření. Aby se tento efekt minimalizoval, doporučuje se proplachovat rozpouštědlem každý používaný kanál Multiwash do promývacího portu a kanál S1 (počáteční chromatografické podmínky) do sedýlka po dobu alespoň 5 minut před zahájením Vaší HPLC analýzy.

Doporučení pro čerpadla a samplery s volitelným vřazeným (inline) filtrem

Limitujícím faktorem pro životnost UHPLC kolon je obvykle vysoký zpětný tlak. Částice ve vzorku se anhromadí na vstupní frite kolony, což způsobuje zvyšování zpětného tlaku až do okamžiku dosažení mezní hodnoty tlaku v systému. Pro zabránění ucpání kolony se doporučuje používání vřazeného filtru (inline). K ucpání kolon také často dochází, když příprava vzorku neumožňuje filtrování nebo když se ve vzorku vytváří sraženina.

Následující moduly mohou být vybaveny etra (vřazeným) inline filtrem:

• Kvartérní čerpadla (G7104A, G7104C, G4204A):
  • Sestava filtru zabudovaného do kapilár (5067-5407)
• Autosamplery 1290 Infinity a 1290 Infinity II Agilent (kromě G5668A, G7137A):
  • Sada filtrů 1290 Infinity II Inline (5067-6189)

Tyto vřazené (inline) filtry s nominální velikostí filtru 0,3 μm chrání UHPLC kolonu před zanesením částicemi ze vzorků nebo ze systému UHPLC.

Výhody filtrů inline:

• Velmi malý vnitřní objem
  • Delay volume s pevnou kapilárou 1,3 μL
  • Delay volume s flexibilní kapilárou 1,6 μL
• Určeno pro práci s vysokými tlaky (max. provozní tlak 1300 bar)

Instalace inline filtru do G4204A nebo G7104A se doporučuje jako ochrana systému před zablokováním v těchto případech:

• Jsou použity kombinace rozpouštědel, které mohou po smíchání způsobit srážení;
• Při provádění aplikací s pufrem nebo přídavnými látkami, pokud se používají kolony s malou velikostí částic

Obecné rady pro efektivní využití inline filtru:

• Před použitím proveďte filtraci rozpouštědel.
• Dodržujte osvědčené postupy.
• U čerpadel G4204A, G7104A/C jednou týdně provádějte zpětný proplach filtru v čerpadle (spusťte oplach filtru pomocí kontextového menu)

  ---

  VAROVÁNÍ Poškození ventilu

  Režim proplachování filtru používejte pouze v případě, že je nainstalován inline filtr, jinak tlakový impulz může poškodit    víceúčelový ventil.

---

• V případě inline filtrů nainstalovaných na autosampleru vyměnte vložku filtru (Vložka 0,3 μm pro inline filtr, 5/pk (5023-0271)) po každých 1000 násřících nebo v případě, kdy zpětný tlak stoupne o 15 %.

Doporučení pro HPLC kolony

• Kolony používejte pouze v označeném směru toku.
• Vždy používejte šroubení vhodná pro specifickou kolonu.
  • Kolony od různých dodavatelů vyžadují různé rozměry šroubení.
  • Použití nevhodného šroubení může mít za následek rozmytí píků nebo dokonce poškození kolony.
  • Společnost Agilent doporučuje pro řešení různorodosti při použití HPLC kolon různých výrobců šroubení InfinityLab.

• Vždy dodržujte provozní a aplikační limity, které jsou uvedeny v uživatelské příručce k používání Vašich HPLC kolon.
• Před použitím kolonu stabilizujte propláchnutím 10 – 20 násobkem objemu kolony.
  • Doporučuje se provést také mezi-propláchnutí kolony s mobilní fází sdaným složením bez přísad/pufrů, a to před stabilizací kolony konečným rozpouštědlem s přisadami/pufry.

Doporučuje se používat ochranné (guard) kolony pro ochranu vlastní kolony a prodloužení její životnosti.

---

POZNÁMKA: Dlouhodobé skladování kolon musí být vždy realizováno s použitím správného rozpouštědla. Více informací o Vámi používaných kolonách naleznete v Uživatelské příručce přiložené ke každé koloně nebo také na webu Agilent Technologies nebo knihovně LabRulezLCMS.

---

Doporučení pro detektory

---

VAROVÁNÍ Časté zapínání a vypínání lampy a Snížení životnosti lampy

• Vyhněte se nepotřebnému zapínání a vypínání lampy.

POZNÁMKA: Po vypnutí lampy a před jejím novým zapnutím je k dispozici bezpečnostní časová prodleva / čekací doba.

---

• Nechte lampu zahřát po dobu alespoň 1 h.
• Udržujte stabilní prostředí a okolní teplotu pro všechny moduly, zejména pro detektor.
• Nikdy nevystavujte detektor přímému slunečnímu záření.
• Nevystavujte detektor silnému proudu vzduchu ze systému HVAC (vzduchotechnika).
• Při připojení druhého detektoru za kazetu jednotky Max-Light namontujte přetlakový ventil
  • P/N G4212-68001 při použití detektorů DAD G4212A/B a G7117A/B/C
  • P/N 0100-3150 při použití detektorů FLD).
• U každého typu detektoru používejte doporučené odpadní hadičky. Zabraňte ohnutí/sevření odpadní trubice za výstupem z cely.
• Zajistěte, aby průtočná celu detektoru byla zbavena bublinek a to propláchnutím izopropanolem nebo jiným organickým rozpouštědlem, dokud není dosaženo stabilní základní linie.
• Pouze pro RI detektory: propláchněte referenční stranu a stranu vzorku čerstvým rozpouštědlem, které se používá pro aktuální aplikaci.
• Po použití průtočnou celu propláchněte.
  • Pro odstranění zbytků soli použijte vodu třídy HPLC.
  • Organická rozpouštědla odstraňte pomocí isopropanolu.
• Před vyjmutím průtočné cely který je určená pro uložení, naplňte tuto celu izopropanolem, aby se zabránilo růstu řas.

Bio Inert a Bio kompatibilní systémy

Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC System
HPLC 1260 Infinity II Prime Bio LC je všestranný systém pro biologické separace a nabízí vynikající funkčnost pro bioanalytickou HPLC a základní kvartérní bio UHPLC při tlacích až 800 bar a průtoku až 5 ml/min.

Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC System
Bioinertní a Biokompatibilní HPLC systém pro analýzu biomolekul a náročné bio aplikace. 100% Bio-inertní materiály v dráze toku vzorku neobsahují žádné kovy.

Doporučení pro biologicky kompatibilní a biologicky inertní systémy

BIO instrumentace - Materiály v dráze toku vzorku neobsahují žádné železo, pouze velmi ušlechtilé materiály.

• Zkontrolujte, zda jsou všechny části použitého spotřebního materiálu (šroubení, kapiláry, vřazené filtry, kolony atd.) biologicky inertní / biologicky kompatibilní.
  • Je potřebné myslet na to, že některé kolony používané pro biotechnologické aplikace mají tělo z nerezové oceli a mohou tak do průtokové cesty vzorku vnést ionty železa a jiných kovů. To může vést k adsorpci citlivých analytů jako jsou fosforylované nukleotidy. V takovém případě použijte kolony z materiálu PEEK.
• Aby se zabránilo ucpání systému způsobenému krystaly solí, systém po používání vysokých koncentrací solí důkladně propláchněte vodou.
• Pokud tlak klesne pod 20 barů, nezlze u čerpadel řady 1290 během analýz zaručit spolehlivý provoz. Pro dosažení optimálních výsledků by měl být tlak nepřetržitě alespoň 50 bar. Proto při použití kolon, které vytvářejí nízký protitlak (<50 bar, například kolony SEC se systémy 1290 LC), instalujte mezi čerpadlo a autosampler restrikční kapiláru a dosáhněte tlaku alespoň 50 bar.
• Pokud je instalován modul pro vícenásobný oplach, provádějte denní propláchnutí multisampleru vodou.

---

VAROVÁNÍ Systémy Agilent Bio-Inert a Bio LC by neměly být vystavovány postupům pasivace nebo podobným.

Mohlo by dojít k nevratnému poškození vnitřních povrchů systému.

- Neprovádějte pasivaci nebo podobné úpravy u biologicky inertních / biologicky kompatibilních systémů.

---

Další informace pro UHPLC čerpadla 1290 Infinity a 1290 Infinity II

Čerpadla Agilent 1290 Infinity a 1290 Infinity II jsou vybavena ventily pro automatický proplach. To umožňuje řadu dalších funkcí, jež nejsou k dispozici v čerpadlech Agilent s ventily pro manuální oplach.

Je tak možné programovat čerpadlo (nastavit parametry a spustit funkce Purge, Condition nebo Prime) pomocí příslušného softwaru.

Funkce Purge

Funkci Purge použijte pro:

• Naplňte systém novým nebo jiným rozpouštědlem
  • Nové rozpouštědlo musí být míchatelné s předchozím rozpouštědlem
  • Pokud je to nutné, zabraňte poškození odplynovače nebo čerpadla pomocí zařazení mezistupně v podobě společně mísitelným rozpouštědlem
• Odstraňte vzduchové bubliny z hadic a hlav pumpy
  • Po několikahodinové nebo dokonce ještě delší nečinnosti čerpadla se může do drah rozpouštědla dostat vzduch.

Jakmile skončí čištění (Purge), modul se automaticky přepne do analytického stavu.

Funkce Condition

Pokud v hlavě čerpadla zůstanou vzduchové mikrobubliny, může dojít ke snížení celkového výkonu čerpadla a může být negativně ovlivněna přesnost průtoku. To se může projevovat jako zvýšený tlak a/nebo zvlnění základního signálu detektoru. Spolehlivým indikátorem takové situace je silně negativní, ale pomalu se zvyšující hodnota signálu ladění (pod –1).

Pro účinné odstranění vzduchu můžete použít funkci Condition. Během kondicionace čerpadlo tlačí mobilní fázi do systému (kolona) a aplikována jsou naposledy použitá nastavení metod, například průtok, složení mobilní fáze a maximální tlak. Analýzu vzorku při tomto procesu provádět není možné.

Pro zajištění účinného odstranění vzduchových bublin ze všech hlav čerpadla používejte přiměřený průtok (například 1,5 mL/min), nastavení složení mobilní fáze (například A: 50 % B: 50 %) a protitlak (>200 bar).

Kondicionaci čerpadla proveďte v následujících případech:

• Nadměrné kolísání tlaku
• Nadměrné kolísání složení mobilní fáze (šum baseline/šum míchání – změny hladiny šumu podle složení mobilní fáze), když jste si jisti, že je typ rozpouštědla nastaven správně a není patrná žádná netěsnost.

Kondicionace může být nezbytná v následujících případech:

• Po dlouhém období pohotovostního režimu
• Po úplném spotřebování rozpouštědla
• Po servisu nebo opravě

  ---

  VAROVÁNÍ Plnění prázdných průtokových cest rozpouštědla a poškození těsnění

• Pro doplnění prázdných cest rozpouštědla použijte stříkačku nebo funkci Purge
• Pro plnění prázdných drah pro rozpouštědla nepoužívejte funkci Prime

  ---

  Funkce Prime

Funkce „Prime“ je užitečná, pokud do hlav čerpadla pronikl vzduch a nelze jej po dobu 15 minut odstranit kondiciováním. Modul čerpá rozpouštědlo ve vysoké rychlosti se všemi pohony čerpadla současně a pouští toto rozpouštědlo do odpadu pomocí automatického purge ventilu. Tento cyklus se provádí 20 krát a zatěžuje to ventil a těsnění rotoru. Proto by to mělo být provedeno pouze jako poslední možnost, před nuceným naplněním hlav čerpadla stříkačkou nebo pokusem o opravu hlav čerpadla.

Funkci Prime použijte na:

• Uvolnění potencionálně zablokovaného ventilu

Popisované funkce mohou být spuštěny pomocí ovládacího rozhraní:

• 1290 Infinity a 1290 Infinity II

1. Klikněte pravým tlačítkem na ovládací panel modulu
2. Zvolte příslušnou funkci pro spuštění postupu

Uživatelsky optimalizované kontextové menu pro přípravu čerpadla nahrazuje klasické menu:

• Čerpadla 1290 Infinity II

1. Klikněte pravým tlačítkem na ovládací panel modulu
2. Zvolte Prepare Pump...
3. Zvolte postup a vyplňte příslušné parametry
4. Klikněte na Start a spusťte zvolený postup

Pro více informací kontaktujte:

Andrea Vernerová
Aplikační specialista (LC, LC/MS)
Tel.: 732 202 694
E-mail: andrea.vernerova@hpst.cz