Analýza a purifikace syntetických oligonukleotidů od začátku do konce. Od výzkumu a vývoje po produkční QA/QC

Syntetické oligonukleotidy jsou krátké řetězce RNA nebo DNA nejčastěji o počtu 15 až 100 jednotek nukleotidů. Mají široké využití v oblasti výzkumu, v genetice i ve forensních vědách. Tato skupina sloučenin zahrnuje i malé interferující RNA, terapeutické antisense oligonukleotidy, aptamery a CRISPR vodící RNA (CRISPR guide)[1]. Tyto látky se vyrábějí synteticky, často s modifikací základní kostry nebo cukru na 2´pozici kvůli stabilitě a farmakologickým účinkům.

Syntéza oligonukleotidů je poměrně složitý proces, kdy při  jednotlivých cyklech vzniká řada vedlejších produktů. Při vývoji a výrobě těchto látek je proto nezbytná podrobná charakterizace nečistot i cílového produktu a jeho purifikace. Charakterizace oligonukleotidů zahrnuje potvrzení jejich molekulové hmotnosti, sekvence nukleotidů, čistoty finálního oligonukleotidu a relativní kvantifikace specifických nečistot. V tomto článku se dozvíte, jaké nástroje nabízí společnost Agilent pro tuto oblast.

HPLC separace oligonukleotidů

Chromatografická separace oligonukleotidů se provádí metodami HPLC, nicméně samotná analýza skrývá řadu nástrah. Oligonukleotidy jsou poměrně polární a především obsahují mnoho záporně nabitých fosfátových funkčních skupin. Separace na běžné reverzní fázi není vhodná z důvodu malé retence. LC separace se proto provádí na silných anexech (SAX) ^1,2 anebo pomocí iontopárové chromatografie na reverzní fázi (IP-RP)^3,4, s triethylaminem jako nejběžnějším iontově párovým činidlem, což je metoda potenciálně kompatibilní i s hmotnostně spektrometrickou detekcí.

Problémem je, že iontopárové činidlo zůstává dlouho v celém LC/MS systému a jeho použití není vhodné v laboratořích, kde je MS detektor využíván i pro jiné aplikace, především v režimu pozitivní ionizace. V nedávno publikovaných aplikačních poznámkách byla s úspěchem použita i separace na chromatografii s hydrofilní-lipofilní interakcí HILIC^5,6, při které se iontopárové činidlo nepoužívá.

Přítomnost velmi polárních fosfátových skupin také vede k negativním sorpčním jevům v běžných HPLC systémech, které obsahují nerezové komponenty. Proto je vhodnější využívat (U)HPLC systémy z ušlechtilých slitin bez přítomnosti železa, které se označují jako biokompatibilní popř. bioinertní. Agilent pro tuto analýzu přímu doporučuje systém 1290 Infinity II Bio ve variantě UHPLC (1300 bar) nebo Prime (800 bar) a kolony série AdvanceBio.

Stanovení čistoty oligonukleotidů

Získání vysoce čistých syntetických oligonukleotidů není snadné. Platí, že s délkou řetězce cílové molekuly klesá výtěžnost výroby a zvyšuje se podíl nečistot. Nečistoty vzniklé při syntéze zahrnují molekuly s kratším nebo naopak delším nukleotidovým řetězcem, nekompletní thiolací, případně se ztrátou bází. K dalším nečistotám patří produkty konverze fosforothioátů na fosfodiestery, produkty oxidace, enzymové nukleázové degradace nebo nečistoty s přítomností chránících skupin, používaných ve výrobě.

Pro stanovení čistoty oligonukleotidů nabízí Agilent dvě ucelená řešení pomocí metod LC/UV nebo LC/MS, viz Obrázek 1. Co se týče MS detektoru, je zde dostačující jednoduchý kvadrupól popřípadě TOF MS, který lze zároveň využít pro profilování nečistot diskutované v následujícím odstavci.

Potvrzení hmoty produktu a profilování nečistot

Podrobná charakterizace vzorku obnáší nejen potvrzení hmoty cílového oligonukleotidu, ale také identifikaci a relativní kvantifikaci nečistot. Vzhledem k rozmanitosti potenciálních nečistot a jejich stopovému množství vůči hlavnímu produktu potřebujeme při profilování nečistot pokročilé analytické metody jako je LC/MS. Zároveň se v rutinní analýze neobejdeme bez pokročilých softwarových nástrojů pro automatické zpracování a interpretaci výsledků. Software Agilent MassHunter BioConfirm 12 umožňuje analýzu dat pro potvrzení hmoty cílového oligonukleotidu a stanovení souvisejících nečistot (Target Plus Impurities, TPI). Tento postup využívá MS dat bez fragmentace, která lze měřit na jednoduchém TOF MS detektoru Agilent 6230B. Obrázek 2 znázorňuje tento postup. Na Obrázku 3 je ilustrace zobrazení výsledků této analýzy v software BioConfirm. Podrobnosti naleznete v aplikační poznámce ⁷.

Konfirmace sekvence oligonukleotidu

Pro konfirmaci sekvence oligonukleotidu se pro cílový oligonukleotid změří MS/MS data s vysokým rozlišením a přesnou hmotou systémem LC/QTOF MS. Software MassHunter BioConfirm 12 potom „namapuje“ tato MS/MS data na předpokládané fragmenty vypočtené z uživatelem zadané sekvence nukleotidů a odpoví na otázku, jak dobře se shoduje skutečná sekvence s tou předpokládanou (pokrytí sekvence, sequence coverage). To je možné díky tomu, že z oligonukleotidové sekvence mohou vznikat pouze určité typy fragmentů  – viz Obrázek 4. Software BioConfirm vypočte sumární vzorce všech předpokládaných fragmentů z dané sekvence, tyto fragmenty potom cíleně hledá v MS/MS spektru a zobrazí jejich detekci na tzv. Fragment confirmation ladder. - viz Obrázek 4. Na základě toho je kvantifikováno pokrytí sekvence (viz Obrázek 5) a jsou zjištěny strukturní modifikace sekvence i v situaci, že celková molekulová hmotnost je identická. Postup pro konfirmaci sekvence oligonukleotidu naleznete na schematu v Obrázku 6. Podrobnosti naleznete v aplikační poznámce⁸.

Purifikace oligonukleotidů

Kromě portfolia pro analýzu oligonukleotidů nabízí Agilent také celé řešení pro jejich purifikaci. Uživatel může volit purifikační systém v širokém rozsahu od analytického měřítka až po preparativní. Kromě samotné instrumentace jsou k dispozici také kolony, software a hotové metody ^9-11. Preparativní systémy jsou samozřejmě  v bioinertním nebo biokompatibilním provedení jako Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert nebo 1290 Infinity II Bio LC.